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编译服务: 可再生能源 编译者: pengh 编译时间: Nov 6, 2019 点击量: 332

用于X射线晶体学,没有尺寸相关的排除或挑战。 为了证明该方法,Sidabras等人。 使用尺寸为0.3毫米x 0.1毫米x 0.1毫米的单晶蛋白质[FeFe]氢化酶(来自巴氏梭菌)。主要作者Jason W. Sidabras,目前是德国马克斯·普朗克化学能转化研究所的Marie Sklowdowska-Curie行动研究员,他进一步评论了与研究员Wolfgang Lubitz教授和Edward J. Reijerse博士一起进行的工作。 “尽管我们从[FeFe]氢化酶开始,但多年来我们一直在尝试研究单晶EPR动力学,

目前的技术不仅限于过渡金属。该研究中定义的方法适用于监测稳定蛋白中间体内的任何酶活性。”他进一步指出,他们的目的是使用该技术降低脉冲EPR技术的现有成本并为节俭科学(经济上代替昂贵的高功率放大器)(经济上具有成本效益的科学策略)。

科学家通常使用EPR光谱研究含顺磁性中间体的氧化还原酶的催化循环,并获得有关活性酶位点的电子和几何结构的信息。通常,为了对蛋白质进行EPR实验,研究人员准备了冷冻溶液(浓度介于0.1到1 mM之间),并将一定体积(200 µl)放入微波腔中,以便在活性部位获得磁相互作用,但对蛋白质的视野有限电子结构。为了完全解决张量磁相互作用参数,他们必须执行单晶EPR实验,在该实验中,磁相互作用张量可以与X射线晶体学结合使用,以证明蛋白质的几何形状并了解酶的催化机理。然而,由于获得具有适当体积和大小的晶体的挑战,单晶EPR很少应用于蛋白质系统。 0.05到0.3 mm范围内的许多蛋白质太小,无法使用商用EPR仪器进行分析。

为了提高EPR灵敏度以研究通常在X波段的单晶,研究人员必须放弃微波腔设计,而转向微波范围的小体积谐振器。该策略可以使用环隙谐振器(LGR)促进将样品量从200 µl减少到200 µl,并使用高介电常数材料进行额外的减少以将有效体积减少到1微升。蛋白质单晶研究需要进一步减少体积(小于0.03 µl),这需要一种彻底的方法。为此,Sidabras等人。在印刷电路板上安装了一个自谐振微螺旋和一个平面微耦合器,从而将自谐振微螺旋置于耦合回路的中心。与其他微谐振器相比,微螺旋几何结构具有以下优势:微波场均匀性大大提高,并且小样本的体积灵敏度更高。该团队针对需要很少微波功率的脉冲和连续波实验优化了自谐振微螺旋。他们可以轻松地在各种样品和温度下匹配和调节微螺旋。

在目前的工作中,研究小组使用自共振微螺旋研究了巴氏梭菌(厌氧细菌)中处于活跃氧化态(HOX;晶体尺寸为3 mm x 0.1 mm x 0.1 mm)的[FeFe]-氢化酶的EPR晶体旋转。 )。 他们在结构上进行了高级脉冲EPR实验,以观察到极好的信噪比。 数据表明使用微螺旋以适合X射线晶体学的体积研究单晶蛋白质。 在实验过程中,研究小组将自谐振微螺旋几何形状缠绕在0.4毫米毛细管上,并将组件连接到与商业EPR系统兼容的定制插件上。 他们使用冷冻溶液进行了连续波EPR实验,并使用场扫描非绝热快速扫描(NARS)实验提高了工作的信噪比(SNR)。

他们在实验过程中使用了长寿命的酪氨酸D自由基(Y?D)作为标准探针,该探针具有以前很好的特性。为了产生酪氨酸自由基(Y?D)EPR信号,研究小组在环境光下照射了光系统II核心复合物(膜蛋白复合物)的样品,并迅速冻结了它们。他们进行了多次实验,以证明在X波段的各种样品(体积小于85纳升)的EPR测量过程中,微螺旋的多功能性。 Sidabras等。尽管构造具有挑战性,但仍使用光系统II晶体作为基准。在结构上,光系统II配合物的分子质量约为350 kDa,每个组分仅包含一个Y?D自由基。总共,每个单位细胞有八个光系统II配合物,科学家计算出8.9 x 1012Y?D自由基,以证明EPR方法的多功能性,可用于研究小晶体尺寸的大型配合物。

在确定自共振微螺旋适合研究单晶蛋白质样品后,研究小组扩大了工作范围,以证明完整的角g张量测定(与分子跃迁相关的能量位移)并检查先进的脉冲EPR实验,例如电子自旋回波包络调制(ESEEM)或超精细子级相关(HYSCORE)。他们为这些实验优化了自共振微螺旋。团队在需氧室中在氧化的HOX状态下对巴氏梭菌(Fe)的[FeFe]氢化酶(Cpl)的[FeFe]氢化酶蛋白质单晶进行了场扫两脉冲ESE(电子自旋回波)EPR实验,在显微镜下观察蛋白质晶体通过毛细作用进入毛细管。

然后,它们将冷冻保护剂和介质包括在微螺旋中,然后进行快速冷冻,以产生具有相对于蛋白质结构的光谱中四个不同信号的EPR信号。 科学家将数据拟合到与通过EPR频谱仿真用EasySpin仿真包定义的不同参考系有关的仿真中。 该团队创建了一个示意图,将[FeFe]-氢化酶H-簇分子框架与实验室系统框架联系起来。 对于实验中检查的所有物种,研究小组使用配体场理论确定了g张量的大小和方向,并使用量子化学计算验证了结果。 该团队促进了对电子结构的基本见解,并指出了它们对配体领域的依赖性,并观察了优化策略的必要性。

研究人员举例说明了用于ESE(电子自旋回波)EPR数据集的HYSCORE(超精细次水平相关)实验进行的单晶研究的更高级实验。为此,他们获得了[FeFe]-氢化酶晶体中H簇的单晶二维光谱,并确定了六个主要跃迁。 Sidabras等。强调了这些先进的EPR技术在当前工作中的可行性,并将它们与使用量子化学计算预测的电子结构相关联。该团队的目标是将来使用ESEEM / HYSCORE技术深入解决配体的其他分子偶联问题。

这样,Jason W. Sidabras和同事提出了一种先进的谐振器,用于设计和收集来自巴氏梭菌(Cpl)呈HOX状态的3 mm x 0.1 mm x 0.1 mm [FeFe]-加氢酶单晶的EPR数据。在本研究中从蛋白质单晶获得的HYSCORE光谱是首次研究。该团队提出的其他工作将促进对蛋白质工程和人工酶研究的进一步洞察,从而创建生物启发和仿生酶体系。值得注意的是,这项工作中设计的自共振微螺旋可以使生物化学家相对于X射线晶体学在晶体尺寸上研究各种催化活性蛋白,这将为酶研究领域的重大进展铺平道路。

 

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