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编译服务: 转基因生物新品种培育 编译者: 雷洁 编译时间: Apr 27, 2016 浏 览 量: 10

CRISPR-Cas系统是细菌编码的适应性免疫系统,该系统通过RNA引导的效应蛋白剪切病毒的DNA或者RNA从而抵抗病毒的感染。该系统之一的CRISPR-Cas9系统被用来作为可编程的基因编辑工具用于细胞内目的DNA的剪切、激活表达、修饰、突变等。由于CRISPR-Cas9系统能够在活细胞中高效地、便捷地“编辑”任何基因,作为科研、医疗等领域的强有力工具,已被广泛地应用于全世界的生物和医学实验室。

刚刚发现的CRISPR-Cpf1系统是一类新型的CRISPR-Cas系统,能够在crRNA引导下在人类细胞内剪切目的DNA底物。而且,Cpf1本身也是一个具有序列特异性的RNase,这也是目前发现的唯一一个具有核酸序列特异性且同时具有DNase和RNase活性的核酸酶。Cpf1和Cas9很大的不同还在于:Cpf1仅需要一个拷贝的crRNA,而Cas9需要序列更长的tracrRNA和crRNA去识别、剪切底物DNA,较短的crRNA在转染细胞过程中将更高效;Cpf1和Cas9识别DNA底物上的模块(PAM)也不同;Cpf1剪切底物是通过粘性末端剪切,而Cas9是末端剪切,粘性末端剪切将更有利于基因编辑后的修复。

在该项研究中,黄志伟团队首先解析了结合了crRNA的Cpf1复合物的晶体结构。非常意外的是,Cpf1并不是之前人们推测的二聚体状态,而是一个呈三角形的单体,位于该结构中间是一个带有正电荷的凹槽。crRNA通过发卡结构形成高度扭曲的构象紧密结合在Cpf1的核酸结合结构域,和底物DNA配对的crRNA 3'末端位于Cpf1凹槽的一端。和Cas9结合的sgRNA显著不同的是,Cpf1结合的crRNA的引导序列部分(guide sequence)并没有电子密度,这说明在没有底物结合的状态下这部分序列和Cpf1的结合比较松散。据黄志伟介绍,结构观察发现一个紧密结合crRNA的六水合镁离子对稳定crRNA构象激活Cpf1的催化活性非常关键。当然,我们也不能排除镁离子也同时直接参与了对底物的催化反应。通过比较Cpf1和Cas9复合物的结构发现,LHD区域推测可能是双链DNA底物结合的PAM区域。

该研究发现Cpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象,crRNA的结合引起Cpf1发生显著的构象变化。与Cas9结合sgRNA极为不同的是,仅仅crRNA的重复序列部分(repeat sequence)就能引起Cpf1构象的巨大变化,这反映了这类短小的crRNA与Cas9结合的长sgRNA的识别机制的巨大差别。该结构显示来自于H843、 K852以及K869催化残基侧链上的氮原子位于一个平面上,同时和RNA A(+20)的磷酸基团形成氢键,该结构证据表明Cpf1剪切pre-crRNA成为crRNA是一个碱催化的反应。

  
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