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2015年第1期(发布时间: Mar 20, 2015 发布者:李阳)  下载: 2015年第1期.doc       全选  导出
1   2015-03-20 10:00:30.553 Dectin-2助力免疫细胞清除结核杆菌 (点击量:3)

日本九州大学的一个研究小组近日在美国《免疫》杂志网络版上报告说,他们发现人体免疫细胞中的一种蛋白质,能有助于免疫细胞清除结核杆菌。这一发现有望促进结核病治疗药物研发。

这种蛋白质名为Dectin-2,位于人体免疫细胞内,具有与糖结合的特性。九州大学生物调控医学研究所教授山崎晶领导的研究小组发现,Dectin-2能识别结核杆菌中最具特征的一种糖脂——脂阿拉伯甘露聚糖,并由此激活免疫细胞,进而清除受感染细胞内的结核杆菌。

在实验中,研究小组发现实验鼠的免疫细胞如果不含Dectin-2蛋白质,就不会对结核杆菌产生反应。

山崎晶表示,这种蛋白质本来就存在于人体内,如果以这种蛋白质为基础研发结核病治疗新药,有望对已经产生耐药性的结核杆菌发挥作用。

2   2015-03-20 10:01:39.46 将转录激活子样效应因子(TALE)切口酶介导的SP110基因敲入牛体内以增加其对结核菌感染的抗性 (点击量:5)

近期,西北农林科技大学的研究人员在《PNAS》杂志上发表题为“TALE nickase-mediated SP110 knockin endows cattle with increased resistance to tuberculosis”的学术论文。在这项研究中,研究人员把小鼠基因SP110通过一种称为转录激活样效应因子核酸酶调控的基因组修饰方法,插入到牛的基因组中,得到了一种转基因牛,它表现出了对牛结核菌感染的抗性,牛结核菌是造成动物与人结核病的一种细菌。

通过同源重组的基因打靶,可以精确地修饰基因组,已被广泛用于基因功能研究和生产转基因动物。转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)是一种可编程的核酸酶,包含一个FokI核酸酶结构域和一个来源于植物病原菌黄单胞菌、被称为“转录激活因子样效应因子”的DNA结合域。TALEN可诱导基因组中一个精确的、定义的位置的双链断裂(DSB),从而在DSBs被非同源末端连接(NHEJ)修复错误时导致不可预料的基因突变。

此外,TALEN也可以用于结合专门设计的外源供体DNA,来产生大规模的缺失、基因中断、DNA增加或单个核苷酸变化。在过去的两年当中,已有众多关于“TALEN介导的基因敲除”的例子报道,但成功的敲入(knockins)是罕见的。TALEN介导的位点特异性转基因技术已成功地应用于模型动物,甚至大型家畜,如猪和牛。然而,据我们所知,利用TALENs技术的基因敲入转基因牛还没有相关报道。

结核病是由牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人畜共患病,可由动物传播给人类以及在人类之间进行传播。它是全球公共卫生和农业的一种严重威胁。牛结核病在世界各地是广泛分布的,目前在非洲和亚洲的许多不发达地区,并没有有效的计划来消除或控制这种疾病。因此,这些地区迫切需要更广泛而有效的牛结核病控制研究。小鼠SP110基因是结核分枝杆菌(MTB)感染控制过程中一个有希望的候选基因。SP110可以控制巨噬细胞中的结核分枝杆菌生长,并诱导感染细胞的细胞凋亡。

在这项研究中,研究人员通过同源重组的转录激活因子样效应因子(TALE)切口酶介导,成功实现了SP110核体蛋白基因(SP110)的敲入,从而产生了抗结核的转基因牛。体外和体内的转染实验表明,转基因牛能够控制牛分枝杆菌的生长和增殖,打开细胞死亡的凋亡通路,而不是感染后坏死,并有效抵抗结核病患牛在自然界的低剂量结核分枝杆菌传播。

在这项研究中,研究人员开发了转录激活因子样效应(TALE)切口酶技术,将一个小鼠SP110基因插入到荷斯坦牛的基因组中。因此,TALEN是这一重要家畜靶向基因改造的一个有效工具。此外,本研究的结果还有助于牛结核病的控制。

3   2015-03-20 10:03:34.057 结核杆菌感染过程中膜联蛋白-1对树突状细胞胞葬作用及交叉递呈的调控 (点击量:3)

结核病(TB)仍然是全球残疾和死亡的主要原因之一。科学家仍在寻找新的途径来消除这种疾病。

结核病传染性极强,疾病是由攻击肺部的细菌即结核分枝杆菌(结核杆菌)扩散导致的。

但由于结核杆菌能够在明显正常免疫系统的个体中存活,科学家们怀疑结核杆菌已经发展战略以逃避甚至颠覆先天免疫和适应性免疫。

麦吉尔大学研究人员Maziar Divangahi教授等人关注于结核杆菌通过呼吸道进入机体途径。

在呼吸道,结核杆菌遇到防守的第一道防线,即肺泡巨噬细胞或噬尘细胞,肺泡巨噬细胞或噬尘细胞驻留在肺并在宿主防御和免疫功能中发挥至关重要的作用。

麦吉尔大学健康中心(RI-MUHC)研究院的成员Divangahi发现导致结核病的细菌不仅能在呼吸道生存下来,同时能在噬尘细胞“充满敌意”的环境中复制,并最终克服身体防御机制,杀死免疫细胞。

4   2015-03-20 10:05:52.693 结核杆菌通过拉拢宿主泛素系统抑制先天免疫 (点击量:5)

肺结核(tuberculosis)是目前世界上致病率与致死率最高的传染病之一,根据世界卫生组织的报告仅2012年中全球患病人数达到了800万人,其中100万以上死亡。随着肺结核的致病菌-结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)近年来抗药性越来越强,许多结核病患者没有得到有效的药物治疗。结核杆菌在长年的进化选择下,能够寄生在宿主的巨噬细胞内部,并能有效避免免疫系统的感知与清除。因而,寻找合适的靶点分子进行药物设计是清除结合杆菌的关键所在。

PtpA是结合杆菌分泌的一类去磷酸化酶(phosphotase: for protein dephosphorylation)。由于其可以分泌到细菌外部,即巨噬细胞胞浆中,所以是最容易设计的药物靶点。然而,目前针对其活性区域的抑制剂特异性不高,导致此类药物副作用太大。最近,中国科学院微生物所刘翠华博士课题组在《nature immunology》杂志在线发表了她们对于结核杆菌分泌的ptpA的致病机制的研究,并希望可以通过此研究成果针对ptpA或者其底物分子设计相关的药物。

首先,作者利用HEK293T以及HELA报告基因模型检测了ptpA对于外界刺激引起的下游转录因子激活的调节作用。研究发现,ptpA可以有效抑制由TNF-a,IL-1b引起的NF-kB激活,而且可以抑制由小G蛋白ras引起的AP-1的激活。作者进一步通过野生型Mtb以及ptpA缺失突变体进行体外巨噬细胞感染。生化检测发现:ptpA可以有效抑制感染过程中NF-kB的激活以及JNK,p38的磷酸化,但是对于ERK蛋白的磷酸化没有明显影响。说明ptpA可以通过某种方式抑制MEK信号通路与NF-kB信号通路的传递。

之后,作者检测了结核杆菌感染巨噬细胞后,细胞内TNF-a,IL-1b的表达水平以及上清中的释放情况,结果显示:缺失ptpA后,结核杆菌能够引起更多的IL-1b以及TNF的产生,在人为地向突变体中转入ptpA后,两种细胞因子的产量收到了抑制。另一方面,如果结核杆菌中过量表达ptpA,那么TNF-a与IL-1b的产量将会受到进一步的抑制。接下来,作者通过腹腔注射的方式向小鼠体内感染结核杆菌,得到了与体外相似的结果,同时,结核杆菌的增殖水平以及组织遭受感染的严重程度也与之相符。以上说明ptpA缺失可以抑制下游细胞因子的表达,从而保护自身不受免疫系统清除。

那么ptpA是如何起作用的呢?作者发现,ptpA的功能受到其去磷酸化活性的影响:当人为地将其催化活性位点突变(D126A)之后, ptpA抑制JNK以及p38的能力均受到了影响,而NF-kB的抑制效应则不受到此影响。之后,作者通过酵母双杂的实验鉴定出泛素蛋白(Ubiquitin)是可能与ptpA相互作用的靶向分子。 通过分子模拟以及突变后的各种生化分析,作者发现ptpA里面有一段a-helix与泛素蛋白存在直接的相互作用。下游的功能检测也证明:ptpA表面a-helix的突变与去磷酸化活性位点的突变均对ptpA的抑制能力产生影响。 体内实验也证实了这一观点。

但是ptpA对NF-kB信号的抑制通并不依赖于ptpA的去磷酸化活性。作者仍旧通过酵母双杂交的方法鉴定出TAB3蛋白与ptpA也存在相互作用。TAB3是TAB家族的成员,在TRAF下游介导NF-kB的激活。作者通过免疫共沉淀技术证明ptpA与TAB3确实存在相互作用,同时发现ptpA能够抑制TRAF2,TRAF6,TAB3等引起的NF-kB的影响,但并不抑制TAK1与TAB1引起的NF-kB的激活。之后,作者发现在有ptpA存在的情况下,TAB3的K-63泛素化受到了抑制,说明ptpA通过抑制TAB3的K-63泛素化来抑制其正常激活NF-kB的功能,TAB3的RNA干扰实验也证实了这一说法。

综上,作者利用一系列生化的手段证明了结核杆菌ptpA抑制巨噬细胞AP-1,NF-kB激活的两种不同的分子机制。也许在临床上我们能够利用这一发现设计更加特异性针对ptpA功能的药物用于治疗结核病患者。

5   2015-03-20 10:07:41.597 牛分枝杆菌的多药敏感性筛查:乙胺丁醇敏感菌株embB基因中新核苷酸多态性研究 (点击量:0)

该研究的主要内容可归纳为以下5个方面:

1. 评价了牛分枝杆菌对6种抗结核药物的敏感性;

2. 研究中采用了一种标准化方法和一种简化的二分刃天青微量滴定法(d-REMA);

3. 二分刃天青微量滴定法(d-REMA)与对照方法的检测结果具有良好的一致性;

4. 在embB基因中鉴定出了4种新的单核苷酸多态性;

5. 未发现embB基因表达谱与乙胺丁醇耐药结果之间存在关联关系。

现对该研究的主要内容作一简要介绍:

来自意大利国立卫生研究院的研究人员采用MiddleBrook 7H11琼脂培养法(金标准)以及一种简化的二分刃天青微量滴定法(d-REMA)评估了源自动物的吡嗪酰胺耐药性牛分枝杆菌分离株对5种抗结核药物的敏感性,其相关成果于2014年12月29日在线发表于国际传染病杂志上。

研究首先对53个牛分枝杆菌分离株进行分类并检测了它们对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卡那霉素及吡嗪酰胺的耐受性(其中吡嗪酰胺为对照组药物);然后基于已获得的耐受性检测结果,对所有分离株的pncA和embB基因进行PCR扩增和DNA测序,发现所有的牛分枝杆菌分离株分为21个间隔区寡核苷酸分型(Spoligotype)/ MIRU-VNTR基因分型,且用琼脂培养法和d-REMA法均检测出所有菌株对吡嗪酰胺耐药。pncA基因测序结果证实H57D突变引起耐药性的产生;接着研究人员采用基于琼脂的金标准法检测出所有菌株对除吡嗪酰胺之外的其它5种药物均敏感,而采用d-REMA法检测出41个菌株对5种药物均敏感,其余12个菌株对乙胺丁醇的耐药检测结果不明确。

此外,研究人员还观察了53个分离株embB基因突变状况,并从中鉴定出4种新的单核苷酸多态性,但采用基于琼脂的金标准法未发现embB基因表达谱与乙胺丁醇耐药结果之间存在关联关系。

综上所述,所有的牛分枝杆菌分离株对一些最常见的抗结核治疗药物均是敏感的;二分刃天青微量滴定法(d-REMA)与基于琼脂的金标准法的检测结果具有良好的一致性;在乙胺丁醇敏感株中发现了4种新型embB突变。

6   2015-03-20 10:09:23.857 加大结核病药物治疗靶点的结构覆盖率 (点击量:0)

结核杆菌(MTB)核心蛋白质的高分辨率三维结构能够为抗结核药物的设计提供模板,但目前仅能够获得(MTB)蛋白质组的一小部分结构。基于此,来自西雅图传染病结构基因组学中心(SSGCID)、西雅图生物医学研究所、默克雪兰诺研发中心以及华盛顿大学等机构的研究人员采用具有保守活性位点的结核杆菌同源物评价了一种属内“同源物救助”策略在完善用于抗结核药物发现的结构信息方面的应用情况,其相关成果于2014年12月19日在线发表于Tuberculosis上。

研究采用X射线对179个潜在的结核病药物靶点进行测定,却仅得到了16个晶体结构。在此基础上若将来源于其它9类分支杆菌菌群的1675个同源物添加入“管道”,则能够获得表征其它52个“顽固性”靶点的结构信息。

为了明确这些同源物结构能否用于结核病药物的设计,研究人员通过度量活性位点的相似性以及连续性药效特性的分布叠加来确定同源物结构,进而比较了106对结核杆菌和非结核杆菌酶同源物的活性位点,发现19对(大于55%的总体序列一致性)具有活性位点Cα RMSD <1Å,且明确了其中超过85%的侧链和超过80%的PSAPF(一种基于药效特性的类似物),从而明确了高度保守的活性位点的形状及其化学性质。如果将此结果用于上面提到的52个非结核杆菌结构,则发现其中41个结构与结核杆菌靶点共享了大于55%的序列一致性,进而提升了179个结核杆菌靶点的有效结构覆盖率。

研究表明,依据同源物结构及同源性结核杆菌酶的测定结果来设计相应的抑制物能够测定蛋白质结构在抗结核病药物设计中的应用状况(例如文中描述的结核杆菌胞苷酸激酶测试实例)。此外,本研究所评价的用于抗结核药物设计的“同源物救助”策略也可以推广到其它疾病药物靶点的研究中。

7   2015-03-20 10:10:45.617 印度孟买的结核病控制使命 (点击量:0)

1. 背景

作为世界上最大、人口最稠密的城市之一,同时也是印度的经济中心,孟买在艾滋病持续流行的背景之下,正在经历着耐药结核病的空前流行。与印度其它大型及增长迅速的城市地区相似,孟买的卫生系统也没有足够的基础设施和专业队伍,且拥有的资源与其它城市也一样,因此人们经常会到许多私人诊所寻求医疗帮助。由于孟买采用的是集中式的结核病治疗模式,从而会产生诸如延误病情、漫长的等待、负担过重的医疗机构中耐药结核病传播风险增加等问题。

2. 行动

2011至2012年,有关人士和媒体对孟买的耐药结核病问题进行了特别报道。2013年3月,孟买市政公司联合其下属的公共和私人卫生部门,与盖茨基金会、世卫组织驻华代表处以及其它一些机构合作实施了一项名为“孟买结核病控制使命”的综合计划,旨在普遍提升结核病的治疗水平,其具体内容包括:(1)到贫民窟找寻活动性结核病例;(2)对结核病例进行诸如药物敏感试验之类的快速检测;(3)改善有效治疗措施的可及性;(4)拓展私人医疗机构的服务范围,并给予医生和患者必要的支持;(5)对感染进行控制;(6)建立结核病定点服务社区,强化相关机构职能。其中市政公司利用从盖茨基金会获得的资助在公共和私人卫生部门之间搭建了一条联系“通道”,并通过一个枢纽中心网络确定了一批非正式医疗服务提供商,目的是要改善城市贫民窟中结核病诊疗的可及性和质量。此外,相关监管机制还强行要求孟买所有的实验室要定期通报每一个结核确诊病例,并提升结核病耐药性检测的水平和可及性。

为了使计划得到有效实施,市政公司还提议可以通过以下途径来提升治疗措施的水平和可及性、延长治疗服务和支持周期:(1)加强公共和私人卫生部门之间的联系;(2)对专业医疗人员进行“内包”;(3)将一个地区的基础设施与另一个地区的专业人员相结合;(4)将治疗服务进行外包;(5)将快速诊断和治疗服务进行协同定位;(6)对医疗机构进行监管。

市政公司还对来自公共卫生部门的管理人员和工程师进行了培训,使其能够针对存在于公共医疗机构的感染采取有效的控制措施。

此外,著名的民间社会成员和宝莱坞影星也被动员来号召全市人民对抗结核病。目前,通过创新筹资机制已经启动了结核病患者的营养支持计划。

3. 实施效果

近些年来,孟买已经采用了多种方法来提升结核病的诊疗水平,并取得了不错的效果,例如开展结核病耐药检测的实验室数量从1升至12,并且很多实验室均引进了新的快速分子诊断技术;指定床位的耐多药结核病住院患者接受治疗的数量从22人增长至310人;私人诊所和实验室联合公共部门来为结核病患者提供优质服务;与2011年相比,2013年接受耐药结核病治疗的患者数量增长了8倍。

4. 展望

在“孟买结核病控制使命”实施的大背景下,孟买将致力于进一步改善结核病患者接受诊疗服务的可及性。此外,这项计划的实施经验也可以作为“探路者”来为这个城市存在的其它社会和健康问题的解决提供一些参考和帮助。

8   2015-03-20 10:12:53.117 PET/ CT显像对接受恶唑烷酮类抗菌药治疗的罹患结核病的人和猕猴的影响研究 (点击量:0)

随着耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)在全球范围内的逐渐增多,研究人员需要采用新型生物标志物来确定某些特殊的TB疗法对于患者是否有效。PET成像一般可用于检测癌症的发生,通过对机体的组织区域进行完全成像来揭示机体器官和组织的功能性情况,或可用于预测结核病的治疗效果。基于此,来自美国国家过敏症和传染病研究所(NIAID)、韩国Changwon国际结核病研究中心、南非开普敦大学传染病与分子医学研究所等机构的研究人员合作分析了正电子发射断层成像技术(PET)、计算机断层扫描技术(CT)联合生物标记物对抗生素药物用于治疗结核病(TB)效果的预测作用,其相关成果于2014年12月3日发表在《科学转化医学》上。

该研究分为两个阶段:在第一阶段,研究人员根据PET/CT扫描结果的变化来监测猕猴接受两种恶唑烷酮类抗生素治疗后的效果,并在对猕猴进行标准治疗(这种标准疗法可以评估TB疗法对个体的作用性)后确定了其肺部残存的结核杆菌含量。随后研究人员让患者服用与猕猴试验相同的抗生素来监测治疗效果,发现PET/CT扫描对病人的监测结果同猕猴基本一致;在第二阶段,研究人员仅对TB患者进行研究,具体为首先观察患者接受治疗前两个月的PET/CT扫描结果,并与传统的痰培养结果进行比较,发现PET/CT扫描可以准确预测患者30个月的预后情况。

综上所述,研究人员表示痰培养结果并不可靠,原因是其不能准确预测患者接受恶唑烷酮类抗生素治疗后的反应及疾病的进展。而PET/CT扫描技术或可在临床研究中帮助预测TB患者接受恶唑烷酮类抗生素治疗后患者的疾病进展情况及预后恢复情况,但还需要更大规模的队列研究来进一步证实这种预测作用。

9   2015-03-20 10:14:17.2 用于全球蛋白质功能及免疫原性研究的结核分枝杆菌全蛋白质组芯片研制 (点击量:0)

就在几年前,人们普遍认为结核病这一古老而又新发的传染病即将成为继天花之后第二种被彻底消灭的疾病。然而,数年过去了,结核病却重新成为了我们的心腹大患,持续性地危害着人类的健康,原因主要有三点:一是疫苗使用近百年,保护率和保护期受到质疑;二是现有主要药物使用历史已约半世纪,耐药性日趋严重;三是诊断缺乏标识物,检出率低。因此,如何能够迅速检测诊断结核病病原体已经成为摆在科研工作者面前的一个重大问题。

基于此,来自中科院生物物理所、上海交通大学、中科院武汉病毒所、广东省结核病控制中心、中科院武汉水生生物所、上海市疾病预防控制中心和广东体必康生物科技有限公司等机构的学者和临床专家们合作构建了首张结核分枝杆菌全蛋白质组芯片,其相关成果于2014年12月11日在线发表于Cell Reports杂志上。

该项研究构建的蛋白质组芯含有4262个结核分枝杆菌基因组阅读框架编码产物,覆盖其基因组编码蛋白质的95%,可用于全局性蛋白-蛋白相互作用分析,以研究人免疫细胞-结核杆菌的互作机制;小分子与蛋白相互作用分析,以进行药物靶标的全局性发现;高通量血清分析,以系统性地进行结核病诊断生物标识物的发现。

此外,文章基于该芯片分析了蛋白激酶PknG及小分子C-di-GMP的相互作用蛋白,发现结核杆菌的鼠李糖通路可能会受到以上两个分子的同步调控,并且还利用芯片发现了14个可以区分结核病人和治愈者的标识蛋白。

  结核分枝杆菌蛋白质组芯片为结核病研究打开了新的窗口,可以系统性发现新的免疫原和标识物,从而发展新型高效疫苗、新药和新的检测技术,是结核病基础研究强有力的新方法学平台。

  该项研究历时五年完成,得到了国家“十二五”传染病重大专项、中科院重点项目、国家863项目以及国家自然科学基金项目等的支持。

10   2015-03-20 10:15:51.313 烟肼对潜伏性结核患者体内抗原特异性干扰素γ分泌的影响研究 (点击量:2)

对于那些被激活风险很高的潜伏性结核感染人群进行治疗是结核病控制和消除战略的一个重要组成部分,然而目前用于评价潜伏结核感染治疗效果的生物标志物尚不明了。这样不仅会削弱结核病的控制力度,还会为新型治疗方案的评价带来不便。基于此,来自墨西哥国家公共卫生研究所、英国帝国理工学院、MRC下属国家医学研究所以及南非开普敦大学等机构的研究人员以结核菌素皮肤试验阳性人群为分析样本,开展了一项随机对照临床研究,其相关成果于2014年10月30日发表在European Respiratory Journal上。

该研究将人群分成两组,其中第一组的26人与结核病患者有接触记录,第二组的34人没有接触记录,各组参与者随机接受异烟肼立即治疗方案或延迟治疗方案。此外,体外测定干扰素-γ分泌对重组性Rv1737的应答状况,并分析了不同种类免疫蛋白重叠合成肽池的情况。

结果显示,在异烟肼治疗期间,干扰素-γ对10-kDa的培养滤液蛋白、Rv2031、Rv0849、Rv1986、Rv2659c、Rv2693c和重组Rv1737蛋白质的应答比例与基线相比升高明显(p≤0.05);异烟肼治疗后,干扰素-γ对Rv0849和Rv1737重组蛋白质肽池的应答比例最高。

IFN-γ在体外对上述蛋白质的应答状况也许有助于明确一些有代表性的标志物,进而能够用于评价潜伏结核感染治疗效果的变化状况。