目录
2014年第1期(发布时间: Dec 18, 2014 发布者:肖宇锋)  下载: 2014年第1期.doc       全选  导出
1   2014-12-18 16:18:36.763 优势丙型肝炎病毒HLA-A*02-限制表位序列改变对CD8+ T细胞启动和交叉反应的影响 (点击量:2)

CD8+ T细胞是对抗丙型肝炎病毒(HCV)适应性免疫反应成功的主要成分。对HCV疫苗设计的一个主要障碍是它的固有序列的多样性。我们检测了如下假说:免疫显性CD8+ T细胞表位的差异序列,均与I型HLA紧密结合,靶向全部不同T细胞受体,并影响CD8+ T细胞应答的质量。对HLA-A*02-限制性丙型肝炎病毒表位NS31406–1415序列差异对来自血清反应阴性捐献者的体外原始CD8+ T细胞的启动及已启动的T细胞的与其他不同表位的交叉反应的影响进行了描述。虽然这六个被检测的不同表位均HLA-A*02:01紧密结合,在CD8+ T细胞的启动和交叉反应中存在本质差别。与具有广泛交叉反应的T细胞最具可再生启动和诱导相关的改变是基因型1b变异体,它在亚洲分离得到的HCV中更为常见而在欧洲和北美很少见。这种相对少见的表位变异体的高免疫原性和交叉反应通过来自注射毒品的人群的HCV特异性记忆CD8+ T细胞得到验证。总而言之,这些数据表明HCV分离种群表位水平的序列差异可能影响CD8+ T细胞的启动及与其他表位变异体的交叉反应水平。

重要性:该结果对设计针对高变异病原体疫苗具有重要意义,揭示出能改善免疫原性和T细胞交叉反应的疫苗抗原序列基于证据的选择。交叉反应性CD8+ T细胞可能对谢爱病毒变异体的传染病毒的免疫控制有利,并可预防急性感染时的免疫逃脱。罕见表位变异体和与广泛交叉反应性T细胞受体启动相关的可能已经改变的表位序列,可被用于疫苗设计中,但仍需进一步验证。

2   2014-12-18 16:19:23.5 蛋白激酶C-相关激酶2对丙型肝炎病毒RNA多聚酶的Ser29 和Ser42的磷酸化调节病毒RNA的复制 (点击量:0)

HCV非结构型蛋白5B (NS5B)是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),它是HCV RNA 复制的关键酶。我们之前的研究表明RdRp是由蛋白激酶C-相关激酶2(PRK2)磷酸化的。在此项研究中,我们用生物化学和反求遗传学方法阐明了HCV NS5B磷酸化对细胞培养中病毒RNA复制非常重要。二维磷酸氨基酸分析揭示了PRK2可在体内或体外专一地磷酸化NS5B的丝氨酸残基。用体外激酶实验和质谱,在与NS5B拇指亚结构域相互作用的Δ1指环区,我们发现两个磷酸化位点,Ser29 和Ser42。 药物选择性HCV亚基因RNA复制子的集落形成实验揭示了以Ala替代Ser29或 Ser42妨碍其磷酸化使得HCV RNA复制受损。进而,通过编码磷酸化缺陷NS5B的HCV感染性克隆进行的反求遗传学研究证实了这些病毒RNA复制总的PRK2磷酸化位点的重要功能。分子模型研究预测NS5B的磷酸化使得它的Δ1环和拇指亚结构域之间的相互作用更为稳定,这是NS5B 的闭合结构的形成是必须的,并对RNA的从头合成至关重要。综上所述,我们的研究显示HCV NS5B磷酸化对HCV RNA复制具有正向调节作用。
重要性:
RNA 依赖的RNA聚合酶(RdRps)在病毒RNA复制中的作用已经非常明确,但磷酸化对其调节功能仍认识不多。在这项研究中,我们阐述了一些重要问题,均与HCV非结构蛋白5B(NS5B)磷酸化后的功能和结构相关。以编码磷酸化缺陷的NS5B突变体的HCV复制子进行反求遗传学研究,对它们的RdRps活性的分析显示之前未知的与HCV复制和NS5B磷酸化相关的NS5B蛋白特征。这些反应了NS5B的Δ1指环结构域与两个识别磷酸化位点Ser29 和 Ser42的磷酸化诱导了潜在的结构改变,并能短暂的影响NS5B的闭合结构。阐明在病毒复制中NS5B磷酸化状态的动力学改变的影响和它们对RNA合成的影响将改善我们对NS5B磷酸化介导调节HCV复制的分子机制的理解。

3   2014-12-18 16:19:37.137 种子序列匹配的控制揭示在丙型肝炎病毒NS5A-MOBKL1B相互作用的功能和结构中小干扰RNA敲除的限制 (点击量:0)

丙型肝炎病毒(HCV)是广泛存在于人类的抗原,可导致肝硬化和肝癌。与其他病毒的情况相似,HCV依靠宿主和病毒因子来完成它的生命周期。研究者用蛋白质组学和酵母双杂方法解释了HCV非结构蛋白NS5A功能相关的宿主因子并发现MOBKL1B与NS5A可相互作用。最初用小干扰RNA(siRNA)敲除的实验揭示出它们在HCV复制中的功能并引导以生物化学和结构方法检测其相互作用。在1.95 Å水平的核心MOBKL1B-NS5A肽复合物的共结晶结构显示,NS5B结合MOBKL1B表面的疏水区域。生物传感器结合实验识别出在NS5A结构域II中的一种高保守性,18个氨基酸结合位点,它包含了亲环蛋白A(CypA)依赖的HCV RNA复制相关的残基。然而,虽然NS5A未与MOBKL1B 相互作用,(CypA)依赖的HCV改变降低了MOBKL1B敲低细胞中的复制。这些不一致的结果促进了更多MOBKL1B基因敲低的研究,包括新增的siRNAs和特异匹配的种子序列siRNA控制。研究人员发现在以MOBKL1B siRNA处理细胞后病毒复制的降低实际上是由抑制的脱靶效应引起的,表明病毒复制依赖MOBKL1B-NS5A相互作用的初始发现是不正确的。最后,用多种方法,发现病毒复制中并无MOBKL1B-NS5A相互作用的关系。综合以上发现提醒研究者和科学评论家们,生物数据的判读siRNA脱靶效应具有较广泛的影响。
重要性:
该研究说明了siRNA基因敲低技术中被低估的缺点。最初识别的细胞蛋白MOBKL1B,可结合HCV的NS5A蛋白。MOBKL1B siRNA,非不相关RNA,与病毒复制的降低和MOBKL1B 的缺失相关。基于HCV的复制依赖MOBKL1B-NS5A相互作用,研究人员进行了结构和生物化学分析。意外的是,缺乏MOBKL1B-NS5A 相互作用的HCV的改变在细胞以MOBKL1B siRNA处理后并不能重复出来。通过重复MOBKL1B siRNA敲低和包括种子序列匹配的siRNA替代无关siRNA作为对照后,发现所使用的MOBKL1B siRNA对病毒复制具有脱靶抑制效应。总而言之,该结果表明在所有的RNA干扰(RNAi)介导的基因敲低实验中必须采用更严格的对照来保证。

4   2014-12-18 16:15:03.027 具有传染性乙型肝炎病毒包膜蛋白的糖基化模式的干扰病毒颗粒易传染,且易中和抗体 (点击量:0)

在抗原循环(AGL)区具有免疫决定性因素的乙型肝炎病毒包膜蛋白(HBV)承担的N-连接的糖基化位点在n146。这是不完全的糖基化位点的功能,导致了近1 / 1的糖化/糖基化的病毒亚型。在这里,我们研究在氨基酸146和功能的糖基化和糖基化的异构体与相关联的N-糖链的精确定位。我们观察到的突变去除的n146糖基化位点是许可的包膜蛋白的合成和稳定的亚病毒颗粒的分泌(SVPS)和丁型肝炎病毒(HDV)病毒,但它不利于HBV病毒颗粒的生产。AGL的几个位置可以代替146的糖基化受体位点。既不是糖链也不是天冬酰胺的146位点很明显是易传染的,但更易选择残渣。

5   2014-12-18 16:19:52.657 病毒的表观遗传调控 (点击量:0)

细胞产生了许多发现和抑制微生物感染的机制。模式识别受体(PRRs)的运用是其中之一。PRRs可表达于细胞表面、胞质、或内涵体,用于发现病原相关分子模式(PAMPs)或被损坏细胞释放的危险信号(如危险相关分子模式,DAMP)。PRR的激活可激发信号级联反应,导致抗微生物细胞因子的产生,包括I型干扰素。这些细胞因子反过来诱导基因的表达,如干扰素诱导基因(ISGs),表现为抗微生物活性。除了PRRs,自噬是另一种细胞外防御机制。细胞以异体吞噬的方式用自噬清除细胞外病原体。病毒为了存活下来已经产生了不同的机制来抑制这些固有免疫反应。一个明显的例子是HCV NS3蛋白酶可将线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)切断。MAVS是能被HCV基因组RNA激活的胞浆模式识别受体RIG-I重要的下游接头分子。另一个例子是流感病毒NS1蛋白,结合E3泛素连接酶TRIM25防止器激活RIG-I。类似地,自噬通路可能被病毒抑制或被病毒利用于自身的复制中。前者以单纯疱疹病毒1的ICP34.5蛋白为代表。后者以HCV为代表,利用自噬增强它的复制。
在Ducroux等的报道中,作者展示了另一种病毒感染的细胞控制。通过运用一系列亲和纯化方法,作者发现Spindlin1是一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的结合对象。他们接下来发现Spindlin1能抑制HBV的复制,因为它的过表达减少了HBV RNA和DNA复制中间物的水平。相反,通过RNA干扰减少Spindlin1增强了HBV复制。他们指出Spindlin1对HBV的抑制效应是在转录水平,因为在核连缀(转录)分析中Spindlin1的过表达减少了HBV DNA的80%的转录活性,Spindlin1对HBV的效应具有特异性,细胞基因cyclinA2未观察到此现象。
Spindlin1有三个Tudor 样结构域并能结合至H3的三甲基赖氨酸4(H3K4me3)和不对称二甲基精氨酸8 (H3R8me2a)。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,Ducroux等揭示出Spindlin1能结合至HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)基因组。有趣的是,这种结合在病毒基因组中HBx的表达消失后会增强,证明了HBx在Spindlin1结合至HBV基因组中的抑制作用。虽然减少Spindlin1实际上导致HBV cccDNA中H3K4me3水平明显增加,Spindlin1似乎并非通过H3K4me3结合至HBV cccDNA。研究结果表明Spindlin1通过结合至HBV cccDNA抑制H3的转录后修饰,从而与活性转录基因相关联。
Spindlin1对HSV-1 RNA的转录也呈现类似的抑制效应。

6   2014-12-18 16:20:08.617 免疫系统受损患者中E型肝炎病毒多聚脯氨酸区的特征 (点击量:1)

E型肝炎病毒(HEV)能在起免疫受损患者,包括固体器官移植(SOT)接受者中引起慢性感染。最近已报道有两个病毒株可与人核糖体基因发生重组。含有插入序列的病毒株在体外复制得更好。这种重组事件的频率或这种插入如何增强复制的还不清楚。研究通过调查59名感染HEV的SOT患者后发现已变为慢性感染的27名患者中,有三个病毒株含有4个重组事件。这4个插入序列具有不同的起源(人类基因或HEV基因组),但是都富含脂质和碱性氨基酸,提供了潜在的调节位点。研究数据表明重组事件发生于大概11%分离自慢性感染患者的病毒株。插入序列的结构为这些插入序列是如何促进病毒复制的提供了新的线索。

7   2014-12-18 16:18:12.757 超变区1对含有进入因子和脂蛋白的丙型肝炎病毒的作用 (点击量:0)

丙型肝炎病毒(HCV)颗粒与脂蛋白相关并通过至少4种细胞进入因子感染细胞。这些因子包括清道夫受体B族I型(SR-BI), CD81, 连接蛋白claudin1 (CLDN1), 和紧密连接蛋白occludin (OCLN)。在HCV细胞进入时哥哥宿主因子的特异性功能和介导这些因子相互作用的病毒结构域所知甚少。病毒包膜蛋白2(E2)的超变区1(HVR1)与SR-BI的利用并隐藏病毒CD81的结合位点有关。去除这个结构域将改变病毒体的密度。比较野生型HCV和病毒成熟中缺失这个结构域的脂蛋白相互作用,表面依附,受体利用和细胞进入后发现,HVR1的缺失不影响CD81, CLDN1, 和OCLN的利用。然而,与野生型HCV不同,HVR1缺失病毒未被靶向SR-BI的抗体和小分子中和。然而,SR-BI细胞表面表达的调节对两种病毒感染有效性的改变相似。亲和纯化病毒分析显示ApoE参入有或无HVR1的病毒的水平相当。然而,参入这些病毒的ApoE被ApoE特异性抗体差异识别。因此,SR-BI在细胞进入时至少有两种功能。一是被SR-BI靶向分子中和,这只对野生型HCV起作用。二是对两种病毒都重要但明显未被升高的SR-BI结合抗体和小分子激活。另外,HVR1可调节病毒相关ApoE的结构和/或表位暴露。
重要性:细胞进入依赖SR-BI,无关HVR1的存在与否。这个结构域调节病毒颗粒表面的ApoE的性质。这项发现有利于SR-BI靶向抗病毒物质的开发,强调了SR-BI在HCV细胞进步时的独立功能并揭示出HVR1对病毒相关脂蛋白的新的作用。

8   2014-12-18 16:20:59.77 甲型肝炎减毒的VP4肽通过分离孔的形成破坏胞膜 (点击量:0)

衣壳结构蛋白成分膜活化肽帮助病毒在感染起始阶段攻克宿主膜屏障。已发现许多这种肽,且它们在膜融合或破坏中的作用通过生理学研究已得到描述。在小核RNA病毒家族中的多个成员中,VP4结构肽在细胞膜穿透中的作用已经明确。然而,该家族中的一个罕见成员,甲型肝炎病毒(HAV)膜穿透性衣壳成分相关的信息还很少。HAV的VP4肽与其他小RNA病毒同类不同的是,它在长度上明显较短,缺乏在VP4介导的膜穿透中关键的豆蔻酰化所需的信号。该研究首次报道了非典型HAV中的VP4含有重要的膜穿透活性。结合生理学方法和分子动力仿真研究,研究者发现VP4通过它的N端区整合到膜囊泡中,最终形成5-9nm直径的分离孔,引起无需改变囊泡总大小和形状的渗漏。之后又发现VP4的膜活性特异性针对在酸性pH 下晚期内涵体中模拟脂成分的囊泡。这些数据表明在HAV进入时,VP4可能对宿主内涵体膜的穿透和病毒基因组的释放起到重要作用。
重要性:甲型肝炎病毒在人类通过粪口途径引起急性肝炎,在卫生条件较差的不发达地区流行更为明显。虽然有HAV疫苗,但费用昂贵,不利于发展中国家的普遍使用。由于培养的病毒生长非常缓慢,对HAV宿主病毒相互作用的研究由于缺乏起始物料而受到限制。HAV的宿主膜穿透行为是其生命周期中未知方面的一种,在病毒感染的起始阶段非常重要。研究表明HAV结构多聚蛋白成分中的小肽VP4可能对病毒进入过程中帮助病毒基因组通过细胞膜起到关键作用。这项研究有助于说明HAV起始宿主细胞相互作用的方式。

9   2014-12-18 16:21:46.133 鞘糖脂和四磷酸受体蛋白2调节丙型肝炎病毒基因组复制 (点击量:0)

丙型肝炎病毒(HCV)募集它的复制复合物至通常为聚集为膜状网络的包膜囊上,在感染过程中,HCV NS5A 蛋白激活PI4KIIIα酶,引起复制复合物脂类磷脂酰肌醇4磷酸脂的大量产生和再分布。然而,HCV生命周期中PI4P的作用还不清楚。研究人员提出PI4P招募宿主效应器调节HCV基因组复制或病毒颗粒的产生的假设,为验证该假设,为靶向PI4P的小发夹RNAs(shRNAs)效应器,4磷酸接头蛋白(FAPP2) 的多西环素可诱导表达建立了细胞系。FAPP2减少削弱了HCV的感染性并阻碍了HCV RNA的合成。实际上,FAPP2有两个PI4P和鞘糖脂特异的功能性脂质结合结构域。PI4P结合突变蛋白的表达可抑制HCV复制,而鞘糖脂结合突变蛋白的表达却意外地引起复制有效性的明显下降。这些数据表明这两个结构域对HCV基因组复制中FAPP2的作用都非常重要。研究人员还发现HCV显著地增加了一些鞘糖脂的水平,二增加这些脂类至FAPP2减少的细胞部分恢复了复制。更说明了HCV RNA合成中鞘糖脂的重要性。有趣的是,FAPP2被重分配到复制复合物中,表现为HCV NS5A,NS4B,或双链RNA中心。另外,FAPP2减少破坏了复制复合物并改变HCV复制酶蛋白的共定位。这些研究都表明HCV利用FAPP2通过PI4P结合和鞘糖脂转运至HCV复制复合物用于病毒基因组复制。

10   2014-12-18 16:24:25.487 丙肝病毒共价闭合环状DNA细胞核的特异性和不降解性 (点击量:0)

目前目前的抗病毒药物可以控制,但不能消除乙型肝炎病毒(HBV),因为HBV建立一个稳定的核共价闭合环状DNA(cccDNA)。干扰素-α治疗可以清除HBV但是会带来全身性的副作用。我们阐述了干扰素-α如何诱导无肝毒性的核病毒DNA特异性降解并提出淋巴毒素-β受体激活可以作为一种治疗选择。干扰素-α和淋巴毒素-β受体的激活上调apobec3a和APOBEC3B胞苷脱氨酶,分别在HBV感染的细胞、肝细,和人肝穿刺活检。乙型肝炎病毒核心蛋白介导共价闭合环状DNA核并与其相互作用,导致胞苷脱氨、脱嘌呤/脱嘧啶的形成,最终共价闭合环状DNA退化,防止HBV再激活。基因组DNA不受影响。因此,例如诱导核脱氨酶,通过淋巴毒素-β受体的激活可以产生新疗法,结合现有的抗病毒药物,可以治疗乙肝。